Caracterización biomolecular de 3500. | Instrumento Co., Ltd del suelo de Hangzhou

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12477 (2023) Citar este artículo

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La momificación en el antiguo Egipto se practicó durante casi 4.000 años como característica clave de algunas de las prácticas mortuorias más complejas documentadas en el registro arqueológico. El embalsamamiento, la preservación del cuerpo y los órganos del difunto para el más allá, era un componente central del proceso de momificación egipcio. Aquí, combinamos análisis GC-MS, HT-GC-MS y LC-MS/MS para examinar bálsamos de momificación excavados hace más de un siglo por Howard Carter en la Tumba KV42 en el Valle de los Reyes. Se rasparon residuos de bálsamo de frascos canópicos ahora vacíos que alguna vez contuvieron los órganos momificados de la noble dama Senetnay, que datan de la dinastía XVIII, ca. 1450 a. C. Nuestro análisis reveló bálsamos compuestos de cera de abejas, aceite vegetal, grasas, betún, resinas de Pinaceae, una sustancia balsámica y resina de árbol damar o pistacia. Estos son los bálsamos más ricos y complejos identificados hasta ahora para este período temprano y arrojan luz sobre los ingredientes de los bálsamos sobre los cuales hay información limitada en fuentes textuales egipcias. Destacan tanto el estatus excepcional de Senetnay como las innumerables conexiones comerciales de los egipcios en el segundo milenio a.C. Ilustran además la excelente conservación posible incluso para restos orgánicos retirados hace mucho tiempo de su contexto arqueológico original.

La sociedad del antiguo Egipto es reconocida, tanto en los círculos académicos como públicos, por los complejos rituales y la extraordinaria cultura material que vinculaba a la muerte, particularmente entre las élites sociales gobernantes1. Ya a finales del Neolítico, los monumentos funerarios se habían convertido en puntos centrales del paisaje para los grupos agrícolas que habitaban la llanura aluvial del Nilo2. Más tarde, estructuras monumentales, desde las primeras mastabas construidas ca. 3000 a. C. a las famosas pirámides de Giza ca. 2600 a. C.3, se convirtieron en elementos clave de la religión, la economía, la sociedad y la política egipcias4. Tan importante fue la elaboración de la esfera funeraria en la cultura del antiguo Egipto que sus necrópolis han sido caracterizadas como “ciudades de los muertos”2.

En el epicentro de esta rica cultura funeraria se encontraban los propios individuos enterrados, quienes fueron sometidos a un conjunto altamente complejo de procesos de momificación post mortem que, con excepción de algunos ejemplos en Chile y China5,6,7, no tienen paralelo en el registro arqueológico. La momificación del antiguo Egipto es anterior a la Primera Dinastía, como se evidencia en los restos de embalsamamiento encontrados en entierros del Neolítico tardío8, y continuó hasta el período grecorromano9, lo que la convierte en una característica central de la arqueología funeraria egipcia. A diferencia de la momificación natural, que puede ocurrir en condiciones áridas como las que se encuentran en el desierto egipcio, la momificación artificial en Egipto implicaba la evisceración y la desecación y preservación deliberadas del cuerpo mediante la aplicación de diversas sustancias10,11. El procedimiento de momificación comprendía la extirpación meticulosa de órganos como los pulmones, el hígado, el estómago y los intestinos, seguida del embalsamamiento12. Los órganos eran frecuentemente, pero no siempre, momificados y almacenados en frascos canópicos separados. Esta práctica sirvió para facilitar la desecación corporal al inhibir el crecimiento de bacterias y hongos. Su objetivo era garantizar la preservación a largo plazo del cuerpo del difunto para la otra vida, proporcionando un recipiente para el regreso de las "almas" del individuo, en línea con los sistemas de creencias egipcios11,13. Los antiguos egipcios tenían una visión multifacética del "alma", concibiéndola como una combinación de varios elementos, en particular Ka, Ba y Akh, que estaban asociados con nociones de la vida futura y rituales funerarios14,15.

Howard Carter descubrió ejemplos de órganos momificados en la tumba real “KV (Kings' Valley) 42” en Tebas (ahora Luxor) en 190016. Las vísceras que encontró en la tumba KV 42 pertenecían a la noble dama Senetnay, que vivía en Egipto. alrededor del 1450 a. C. Fue nodriza del tan esperado hijo y heredero del faraón Tutmosis III, el futuro faraón Amenhotep II, que fue criado y amamantado por Senetnay durante la infancia17. Después de su muerte, los órganos momificados de Senetnay fueron cuidadosamente almacenados en cuatro frascos canopos con tapas en forma de cabezas humanas (Fig. 1). Para preservar sus restos para el más allá, fueron embalsamados, asegurando su conservación a largo plazo, aparentemente para la eternidad. Dos de los frascos, los fabricados para contener los pulmones y el hígado de Senetnay, se conservan actualmente en la colección egipcia del Museo August Kestner de Hannover (Alemania)17,18. Si bien los órganos momificados se han perdido y los frascos están actualmente vacíos, los residuos de los bálsamos de momificación se conservan parcialmente como finas capas en las paredes y bases de los frascos, además de penetrar en la piedra caliza porosa de la que están hechos los frascos. .

© Museo August Kestner, Hannover (Alemania); foto: Christian Tepper (fotógrafo del museo). (b) Mapa del Valle de los Reyes con la ubicación de la Tumba KV 42, donde se encontraron las vasijas canopos. Fuentes de mapas: Weeks, Kent R. (ed.). Atlas del Valle de los Reyes (= Publicaciones del Proyecto de Cartografía Tebana, 1). Cairo: American University in Cairo Press, 2000, 2003. Disponible en línea en https://thebanmappingproject.com/sites/default/files/plans/Valley%20of%20the%20Kings.pdf, y datos de mapas vectoriales de Natural Earth (los mapas fueron creado usando QGIS 3.12 (https://qgis.org/en/site/)).

(a) Jarra canópica de Senetnay, “Nodriza del Rey” (Amenhotep II), que originalmente contenía los pulmones momificados de Senetnay, como se desprende de las inscripciones en la vasija que se refieren a Neftis, la diosa protectora de los pulmones. Alto del tarro con tapa: 42,4 cm; altura sin tapa: 33,7 cm; máx. diámetro: 21,5 cm.

Las recetas exactas utilizadas en los bálsamos de momificación del antiguo Egipto han sido debatidas durante mucho tiempo debido a la escasez de textos del antiguo Egipto que nombran sus ingredientes precisos19. A pesar del largo período durante el cual se practicó la momificación (casi 4000 años), existen sólo unas pocas fuentes escritas—como el Ritual de Embalsamamiento20—que abordan el proceso de momificación, y ninguno de estos textos proporciona los ingredientes exactos utilizados en la preparación de la momificación. los bálsamos. Descripciones históricas de fuentes griegas y romanas muy posteriores (por ejemplo, Heródoto, Diodoro Siculus21,22) especifican algunos ingredientes, pero no eran necesariamente los mismos que los empleados más de un milenio antes. Por estas razones, el uso de análisis moleculares para ayudar a identificar los ingredientes de los materiales de embalsamamiento del antiguo Egipto ha sido de gran interés para los científicos desde finales de los años 197023. En particular, los avances tecnológicos en cromatografía de gases y técnicas de espectrometría de masas han contribuido significativamente a dilucidar la química de los bálsamos del antiguo Egipto24,25. Estudios anteriores han identificado una serie de ingredientes diferentes que se utilizaron en la producción de bálsamos de momificación, en diversas configuraciones, como aceites y grasas9,26,27,28,29,30,31, cera de abejas9,29,30,32,33. , betún8,28,34,35, gomas y azúcares8,9,32, y resinas y alquitranes8,27,28,31,33,34,36,37,38,39,40,41. Sin embargo, la mayoría de estos estudios se centraron en materiales de embalsamamiento obtenidos de los vendajes y tejidos de las propias momias, y sólo unos pocos estudios se han llevado a cabo sobre las sustancias utilizadas para embalsamar los órganos acompañantes en los frascos canópicos28,33,42 (ver también el Canópico Proyecto Jar en la Universidad de Zurich).

Aquí, con el fin de dilucidar qué conocimientos sociales, tecnológicos y culturales más amplios se pueden adquirir a partir de los bálsamos utilizados para momificar órganos, investigamos muestras de bálsamo de dos de los frascos canópicos pertenecientes a Senetnay (los otros dos frascos pertenecientes al conjunto no están disponibles). para análisis, ya que uno se encuentra en el Museo Egipcio de El Cairo mientras que la ubicación del otro permanece indeterminada). Los frascos analizados son los que contenían los pulmones y el hígado de Senetnay, y fueron almacenados inicialmente en Egipto, luego en la colección privada del egiptólogo Friedrich Wilhelm Baron von Bissing en Munich, luego en el Museo Carnegielaan 12 de La Haya, y finalmente, desde 1935, en la colección egipcia del Museo August Kestner de Hannover (con dos años de almacenamiento de seguridad en una mina de sal de Grasleben durante la Segunda Guerra Mundial)17,18. En cada lugar, durante más de 123 años, los restos fueron almacenados en “condiciones de museo” más o menos ideales. Comprender la complejidad de los residuos orgánicos antiguos, especialmente las mezclas de diferentes productos, requiere el análisis de múltiples grupos de compuestos. En reconocimiento de la diversidad química de los componentes biológicos en muchos bálsamos de momificación analizados, recurrimos a un enfoque multianalítico que combina espectrometría de masas con cromatografía de gases (GC-MS), espectrometría de masas con cromatografía de gases de alta temperatura (HT-GC-MS) y espectrometría de masas con cromatografía de gases de alta temperatura (HT-GC-MS) y líquido. cromatografía espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) para diferenciar e identificar las sustancias orgánicas contenidas en los frascos canópicos de Senetnay.

Se seleccionaron un total de 6 muestras de bálsamo para el análisis, que comprenden una muestra del fondo y dos muestras de las paredes internas de cada uno de los frascos canópicos (consulte la Figura complementaria S1 y la Tabla S1 para conocer la ubicación exacta y la descripción de las muestras). Las muestras de bálsamo se sometieron a una serie de pasos de extracción/disolución seguidos de análisis LC-MS/MS, GC-MS y HT-GC-MS. Los resultados, que se detallan a continuación, muestran una buena conservación de las moléculas en las muestras tomadas del fondo interior de los frascos (es decir, AES 062 del frasco 1 y AES 067 del frasco 2), donde permanecieron adheridas capas residuales del material de embalsamamiento. Por el contrario, los residuos raspados de las paredes interiores, que fueron parcialmente absorbidos por la piedra caliza del frasco y apenas visibles a simple vista, demostraron una peor conservación molecular.

Se identificaron tres grupos de compuestos en los extractos analizados por LC-MS/MS en modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM): terpenoides, fenoles y compuestos aromáticos (Tabla 1). Los resultados de LC-MS/MS mostraron una gran abundancia de diterpenoides y triterpenoides en el material de embalsamamiento. Entre los diterpenoides predomina el ácido 7-oxo-deshidroabiético (7ODHA, Tabla 1), que se observó en todas las muestras. 7ODHA es un derivado oxidado del ácido diterpeno deshidroabiético (DHA), que también estaba presente en menor medida. Ambos compuestos son característicos de los productos vegetales de coníferas, específicamente de las resinas de la familia Pinaceae, incluyendo el pino (Pinus spp.), el alerce (Larix spp.) y el cedro (Cedrus spp.)8,9,28,34,41. También se incluyeron otros compuestos característicos de las resinas de Pinaceae como estándares analíticos para la optimización de los parámetros de MRM, en particular los ácidos pimárico, isopimárico, palustrico y neoabiético43. Sin embargo, debido a tiempos de retención similares, patrones de fragmentación y pesos moleculares (302 g/mol), LC-MS/MS y la detección en modo MRM no fueron suficientes para diferenciarlos. Por lo tanto, el ácido pimárico, el ácido isopimárico, el ácido palustrico y el ácido neoabiético se resumen en la Tabla 1 como 'ácidos resínicos' (ver también la Tabla complementaria S5), y las muestras se analizaron adicionalmente mediante GC-MS para diferenciar estos compuestos (ver GC –Análisis MS y HT-GC–MS).

Los triterpenoides detectados en las muestras sugieren el uso de sustancias resinosas perfumadas adicionales. El ácido damarenólico (Fig. 2a, c), el principal metabolito secundario de la resina damaran44, estaba presente en la muestra AES 062 del frasco canópico 1. Este compuesto triterpenoide es una molécula de tipo damarano, pero con la apertura del anillo A debido a oxidación y rotura del enlace C-C, dando como resultado un grupo funcional carboxilo45. Curiosamente, este compuesto solo se detectó en el frasco 1 y no en ninguna de las muestras tomadas del frasco canópico 2. Nuestro análisis también reveló un pico correspondiente al ácido oleanónico o morónico, dos triterpenoides pentacíclicos que tienen estructuras y comportamientos de ionización similares, y son en consecuencia, difícil de distinguir. Sin embargo, este pico solo se detectó en baja abundancia (Fig. 2b, d). El ácido oleanónico y el ácido morónico son biomarcadores típicos de las especies de Pistacia y se han detectado previamente en varios materiales de embalsamamiento del antiguo Egipto9,28,36. Sin embargo, en combinación con el ácido damarrenólico, el ácido oleanónico también es un constituyente de la resina damamar de la familia Dipterocarpaceae, entre otros clados de angiospermas45,46,47. Además de su aparición natural en la resina dammar, el ácido dammarenólico también podría ser un producto de oxidación del compuesto dammaradienona, que está presente tanto en la resina dammar como en la resina de Pistacia (Fig. 2e)46,48. Estudios anteriores sobre bálsamos de momificación también han observado la superposición entre los compuestos encontrados en dammar y Pistacia28,49. Por lo tanto, según la evidencia actual, las resinas de pistacia y dammar no se pueden diferenciar sin ambigüedades y, por lo tanto, ambas resinas se consideran posibles fuentes de estos compuestos.

Cromatogramas de HPLC de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) de los estándares analíticos ácido damarrenólico (a) y ácido oleanónico (b) en comparación con la presencia de estos compuestos en la muestra AES 062 del frasco canópico 1 (c,d). (e) Estructuras químicas de etapas de oxidación secuenciales de moléculas de tipo damarano después de 47.

Además de los terpenoides, también se detectaron compuestos fenólicos y aromáticos en los bálsamos, como ácido vainílico, cumarina y ácido benzoico. Aunque el ácido vainílico se encuentra en los extractos naturales de vainilla, en este contexto lo más probable es que refleje la degradación del tejido leñoso50,51,52 y posiblemente derive de las coníferas del bálsamo. Es más difícil asignar un origen al compuesto aromático cumarina, ya que se encuentra naturalmente en una amplia gama de plantas diferentes y relacionadas de manera dispar, entre las que se encuentran las canelas y muchas Fabaceae. La cumarina tiene un aroma parecido al de la vainilla. En todas las muestras se encontró otro compuesto aromático, el ácido benzoico. También se encuentra en muchas gomas y especias vegetales, como la goma de benjuí, la canela y el clavo o plantas tipo bálsamo32,53. Dada la ubicuidad de estos compuestos en el reino vegetal, no pudimos asignarlos a una fuente específica.

Se llevaron a cabo mediciones adicionales de GC-MS de la fracción lipídica para analizar ácidos grasos y alcoholes, n-alcanos y ácidos resínicos (Fig. 4a). De manera similar a los resultados de LC-MS/MS, se detectaron 7ODHA y DHA en la fracción lipídica junto con ácido abiético, ácido pimárico, ácido isopimárico y ácido 15-hidroxideshidroabiético. Este último es otro producto de oxidación que se forma a partir del ácido abiético y el DHA (Fig. 3). Estos ácidos resínicos se identificaron sólo en las muestras AES 062 y AES 067 tomadas del fondo de los frascos, pero no en las muestras restantes, que tenían una concentración global más baja de moléculas orgánicas (menos de una décima parte en comparación con las muestras basadas en AES 062 y AES 067). sobre el área total del pico). Todos los diterpenoides identificados se encuentran en todos los géneros de Pinaceae, aunque la abundancia de los ácidos resínicos primarios, ácido pimárico y ácido abiético, es más característica de las resinas de las especies de Pinus34. Además de estos biomarcadores para las resinas de Pinaceae, también detectamos el compuesto larixol (Figura complementaria S6) en la muestra AES 062. Al igual que los ácidos resínicos mencionados anteriormente, el larixol también está presente en la resina de madera de alerce (Larix spp.)54,55 ,56,57, y de hecho es específico de él. Por tanto, su presencia sugiere una especie de Larix como posible fuente de resina de Pinaceae. Sin embargo, este hallazgo debe tratarse con precaución, ya que se basa en un único biomarcador. Además, tampoco se puede descartar una mezcla de diferentes géneros de Pinaceae, incluidas las resinas de pino y alerce.

Ácidos resínicos presentes en muestras de ambos frascos canópicos y reacciones de oxidación secuenciales del ácido abiético.

Además de las resinas odoríferas, el análisis de la fracción lipídica reveló que el bálsamo contenía ingredientes adicionales (Fig. 4b). El perfil estuvo dominado por una gran abundancia de ácidos grasos saturados de cadena lineal con números pares de carbonos, predominantemente ácido palmítico (C16:0) y ácido lignocérico (C24:0) y, en menor medida, ácido behénico (C22:0). y ácido esteárico (C18:0). Estos ácidos grasos libres son productos finales de la degradación de sustancias lipídicas y pueden indicar una contribución de aceites vegetales o grasas animales/humanas52,58,59. La gran cantidad de ácidos grasos de cadena muy larga (C22:0–C30:0) es característica de las plantas terrestres superiores y de las ceras epicuticulares, así como de la cera de abejas60. Los componentes de cadena lineal con números de carbono impares detectados en las muestras [p. ej., ácido pentadecanoico (C15:0) y ácido heptadecanoico (C17:0)] a veces se consideran característicos de los lípidos de rumiantes. Sin embargo, su baja abundancia y la ausencia de los isómeros ramificados correspondientes sugieren que estos compuestos son más probablemente el resultado de una degradación bacteriana61,62. Las muestras también exhiben homólogos de cadena corta de C6:0–C10:0, que se sabe que son productos de degradación causados por la oxidación y formados durante el envejecimiento o el secado de tejido orgánico, por ejemplo, de aceite vegetal28,59,63. Los ácidos grasos monoinsaturados también están presentes en forma de ácido octadecenoico (C18:1) y ácido hexadecenoico (C16:1), que se encuentran en aceites vegetales y grasas animales52. Por lo tanto, la distribución de ácidos grasos sugiere que lo más probable es que los bálsamos incluyeran una mezcla de grasas animales y aceites vegetales degradados. Sin embargo, se requiere cierta cautela en la interpretación, ya que no podemos distinguir entre la grasa que deriva de un ingrediente animal añadido o los propios restos humanos.

Corriente iónica total (TIC, a) y cromatogramas de iones extraídos (EIC, b – f) de la muestra AES 062 que muestran masas iónicas de fragmentos característicos de las principales clases de compuestos. (b) m/z 117 que muestra ácidos grasos, n:0 = FA saturados y n:1 = FA insaturados; (c) m/z 103 que muestra la distribución de alcoholes grasos; (d) m/z 85 que muestra n-alcanos con los números de carbono correspondientes y (e,f) fragmentos característicos de hopanos y esteranos. Para obtener información más detallada sobre hopanos y esteranos, consulte las figuras complementarias. S4, S5. Para los compuestos identificados de las muestras AES 067, consulte la figura complementaria S2.

Otra clase de compuestos presentes en la fracción lipídica fueron los n-alcanos, que representan los compuestos más abundantes en la muestra AES 062. Los extractos produjeron n-alcanos de cadena media y larga (C20-C36), que muestran una ligera proporción impar sobre par. Predominio, con C27 como el n-alcano más abundante (Fig. 4d). Dada la presencia de esta serie homóloga de n-alcanos, que es característica de los hidrocarburos fósiles, planteamos la hipótesis de que los n-alcanos podrían reflejar betún, una sustancia a menudo asociada con la momificación egipcia28,64,65. Por esta razón, seleccionamos hopanos y esteranos característicos del betún (iones m/z 191 y m/z 217; Fig. 4e, fy Figs. Suplementarias S4 y S5). Estos iones son marcadores diagnósticos del petróleo natural8,66,67 y fueron detectados en las muestras de ambas vasijas canópicas, confirmando así la presencia de betún.

También se sabe que los n-alcanos con una longitud de cadena de C25 a C35, pero una fuerte dominancia impar sobre par, son característicos de las ceras epicuticulares de plantas terrestres superiores59,68,69, y de la cera de abejas, como se ha informado en estudios anteriores. estudios de bálsamo de momia29,36,60. La cera de abejas suele estar compuesta también de ésteres de cera con una longitud de cadena de carbono superior a 40. Las muestras AES 062 y 067 se analizaron adicionalmente mediante HT-GC-MS para buscar estos ésteres de cera. Detectamos pequeñas cantidades de monoésteres de ácido palmítico que van desde C40 a C50, así como los correspondientes ésteres de hidroxicera (Fig. 5) en ambas muestras. La presencia de ésteres de cera, la distribución de n-alcanos con el pico más abundante para C27, los ácidos grasos de cadena larga y los n-alcanos (Fig. 4c) proporcionan evidencia sólida del uso de cera de abejas como ingrediente destacado en la bálsamos.

Cromatogramas de iones extraídos (EIC) de análisis HT-GC-MS para los valores de m/z 257 y 117 de la muestra AES 062 que muestran monoésteres de ácido palmítico (a) y ésteres de ácido hidroxipalmítico (b).

Nuestro análisis muestra que se puede recuperar rica información de los restos de bálsamos en vasijas canópicas egipcias, incluso cuando dichas vasijas han sido vaciadas y transferidas entre colecciones de museos durante más de un siglo. Las muestras tomadas de los frascos de Senetnay proporcionan evidencia de la incorporación de una variedad de productos naturales e ingredientes olorosos en los bálsamos utilizados para preservar sus órganos. Aceites y grasas, junto con cera de abejas y betún, parecen haber formado la base de los bálsamos identificados en ambos frascos, y nuestro análisis demuestra que estas sustancias estaban mezcladas con resinas de coníferas, específicamente de Pinaceae. Además, nuestros análisis revelaron la presencia de otros productos vegetales no identificados que contienen ácido benzoico y cumarina. Análisis previos de otros bálsamos egipcios también han observado ácido benzoico, junto con ácidos fenólicos, que se han asociado con la presencia de exudados de plantas aromáticas de resinas o gomas balsámicas9,10.

El análisis reveló además que los bálsamos de los dos frascos de Senetnay no eran idénticos en composición. El bálsamo del frasco canópico 1, que originalmente contenía los pulmones de Senetnay, incluía una resina aromática adicional (probablemente resina de dammar o Pistacia) que no se encontró en el frasco 2 (que contenía su hígado momificado). Además, el compuesto larixol, que sugiere resina de alerce, solo se detectó en el frasco 1. Aparte de estos ingredientes, la composición de los bálsamos en los dos frascos parece haber sido muy similar, aunque las proporciones de los ingredientes en cada uno son diferentes. Las diferencias en la composición química de los bálsamos podrían sugerir que los bálsamos eran específicos de un órgano, destacando la importancia de investigaciones en profundidad de los bálsamos de los frascos canópicos. Sin embargo, dado que las muestras de las vasijas canópicas de Senetnay tienen casi 3500 años de antigüedad y que probablemente se produjeron múltiples procesos de degradación durante el período de deposición y almacenamiento, no podemos excluir la posibilidad de que los ingredientes resinosos fueran originalmente los mismos pero se hayan degradado de manera diferente a través del tiempo. tiempo. Además, es posible que el bálsamo de momificación fuera heterogéneo y que los ingredientes no estuvieran bien mezclados ni distribuidos uniformemente. Sin embargo, encontramos cierto apoyo para la noción de recetas de bálsamos específicas para órganos en un estudio reciente de vasijas con inscripciones para la preparación de materiales de embalsamamiento de un taller de momificación en Saqqara, que data de mediados del primer milenio a. C.31. En el ejemplo de Saqqara, las diferentes mezclas no se encontraron en vasos canópicos, sino en vasijas en las que se preparaban bálsamos de momificación para su posterior aplicación en el hígado y el estómago. Por el contrario, nuestro estudio analizó bálsamos derivados de órganos ya embalsamados y nuestros resultados brindan apoyo provisional a la hipótesis de que se aplicaron diferentes bálsamos a diferentes órganos.

Nuestra revisión de la literatura sobre análisis de bálsamos anteriores muestra que algunos de los ingredientes que encontramos en los bálsamos de momificación utilizados en los órganos de Senetnay (por ejemplo, betún) no se usaban comúnmente para embalsamamiento en el Egipto del Reino Nuevo. Análisis anteriores sugieren que los bálsamos de momificación del antiguo Egipto contenían una gama limitada de ingredientes antes del Tercer Período Intermedio (c. 1000 a. C.), volviéndose más complejos con el tiempo24. Si bien el análisis de los primeros bálsamos ha revelado el uso de múltiples ingredientes8, los bálsamos egipcios de los Reinos Antiguo y Medio a menudo consistían únicamente en grasas o aceites (Fig. 6A). Sólo en el Segundo Período Intermedio y el Imperio Nuevo (c. 1760-1077 a. C.) los bálsamos se volvieron más complejos, con la introducción de diversas resinas, lo que probablemente refleja tanto la evolución de los enfoques de la momificación como la creciente capacidad de adquirir ingredientes de lugares más lejanos24. En general, a mediados del segundo milenio a. C., cuando murió Senetnay, sólo un pequeño número de momias recibieron este tipo de tratamiento elaborado.

(a) Presencia de sustancias reportadas en bálsamos egipcios a través del tiempo (fuentes:8,9,24,26,27,28,29,31,32,35,36,37,38,40,41,49,62,70 ,71,72,73,74). (b) Composición de bálsamos de momificación del Imperio Nuevo, contemporáneos a Senetnay, y bálsamos seleccionados del Tercer Período Intermedio al Período Ptolemaico que constan de 4 o más sustancias.

Otros ejemplos de bálsamos sofisticados en este período provienen del entierro de alto estatus de la XVIII Dinastía (ca. 1479-1424 a. C.) de un dignatario llamado Nebiri49, así como de las momias del arquitecto real Kha y su esposa Merit70. Cuando se analizaron, se encontró que estos bálsamos contenían grasas y aceites, resinas de coníferas y productos o gomas de plantas aromáticas. Los bálsamos de Nebiri y Merit también contenían resina de pistacia y el embalsamamiento de Merit también contenía cera de abejas. El embalsamamiento de Senetnay, también de la XVIII Dinastía y contemporáneo o ligeramente más reciente que el entierro de Nebiri, pero anterior a los de Kha y Merit, presentaba otro bálsamo único y distintivo. Entre ellos se encontraban la cera de abejas y la grasa/aceite, así como una sustancia aromática o balsámica, junto con resina de coníferas (posiblemente resina de alerce) y resina de pistacia o incluso un componente muy exótico en forma de resina de damar. Además, los bálsamos de Senetnay también contenían betún, lo que demuestra el uso muy temprano de esta sustancia natural en el contexto de la momificación. Los análisis químicos no han arrojado ningún otro ejemplo de un bálsamo tan complejo con 6 ingredientes (en el frasco 1) a mediados del segundo milenio a. C. en Egipto (Fig. 6B). La cera de abejas y el betún tampoco se convirtieron en ingredientes importantes de los bálsamos de momificación hasta finales del Imperio Nuevo. En general, los bálsamos utilizados en las vasijas de Senetnay contienen ingredientes que se emplearon comúnmente en Egipto sólo en períodos posteriores, particularmente en el "culmen de la momificación" en el primer milenio a. C., cuando los bálsamos se volvieron más complejos y elaborados. Por lo tanto, el bálsamo de Senetnay podría verse como un precursor de una tendencia posterior. Es importante señalar, sin embargo, que el mayor número de ingredientes identificados en el bálsamo de Senetnay podría simplemente reflejar una mejor conservación y/o nuestro enfoque multianalítico, que implicó el uso combinado de GC-MS, HT-GC-MS y LC. –MS/MS, permitiendo un enfoque más holístico para el estudio de las muestras de bálsamo. Si bien la Fig. 6 sintetiza datos de una variedad de estudios, la preparación de muestras y los enfoques analíticos de estudios analíticos anteriores han variado y no son directamente comparables. Es probable que el betún en particular esté subrepresentado debido a la necesidad de procedimientos especializados en la preparación de muestras.

A pesar de estas advertencias, los restos de Senetnay parecen haber recibido un trato especial. Los ingredientes de sus bálsamos de momificación dan la impresión de una mujer de posición social excepcional, lo que sugiere, junto con otras líneas de evidencia, que era un miembro muy valorado del séquito del faraón. El elaborado tratamiento de los restos de Senetnay se refleja en el patrón más amplio de su entierro. Su sola presencia en el Valle de los Reyes, una necrópolis normalmente reservada para faraones y nobles poderosos75, apunta a un privilegio extraordinario y a la alta estima que probablemente tenía Senetnay por parte del faraón. Su título, “Ornamento del Rey”17, refuerza aún más la evidencia de su posición especial.

De acuerdo con estas indicaciones de una mujer de estatus prominente están los orígenes de los ingredientes de los bálsamos empleados en los frascos canopos de Senetnay. La mayoría de los ingredientes de sus bálsamos no eran de origen local y, por tanto, dependían del transporte para estar disponibles en Egipto. Los árboles de la familia de los pinos, por ejemplo, no son endémicos de Egipto (Fig. 7a). Como se señaló, una posible fuente de resina de Pinaceae son las resinas de madera de alerce de la especie Larix, según nuestro hallazgo del compuesto larixol. La resina de alerce también se ha identificado en remedios médicos históricos en Roma basándose en la presencia del compuesto larixol76. Hay diez especies reconocidas en el género Larix, de las cuales sólo una es nativa de Europa (L. decidua)77, mientras que ninguna es nativa del suroeste de Asia o África78. Si bien hay especies nativas de Siberia (L. sibirica; L. gmelinii) y cadenas montañosas del sur de Asia como el Himalaya (L. potaninii; L. mastersiana y L. griffithii), éstas están mucho más lejos de Egipto y, por lo tanto, menos fuentes plausibles para la resina en este estudio. L. decidua existe en poblaciones de refugio en las cimas de las montañas de los Pirineos, los Alpes y otras montañas del Mediterráneo occidental y de Europa central, y podría haberse obtenido a través del comercio marítimo, aunque en la actualidad no se conocen bien los supuestos contactos comerciales de Egipto con Europa central79.Otras pináceas Sin embargo, también son posibles fuentes, y las cercanas al antiguo reino egipcio podrían haber incluido el abeto de Cilicia (Abies cilicia), el cedro libanés y del Atlas (Cedrus libani y atlantica), el abeto asiático (Picea orientalis), el pino carrasco (Pinus halepenis) y el pino parasol (P. pinea). El pino turco (P. brutia) y el pino marítimo (P. pinaster) crecen más al norte del Mediterráneo, especialmente en muchas islas y zonas costeras del norte. Si bien hay cierta evidencia de cambios de población entre algunas de estas coníferas, en particular la reducción del área de distribución a mediados del Holoceno80, no hay razón para creer que haya especies que existieron en Egipto durante los últimos tres milenios pero que ya no están presentes. Por lo tanto, lo más probable es que los ingredientes de coníferas que contienen los bálsamos sean productos importados.

(a) Mapa que muestra la distribución de fuentes potenciales de resina de coníferas en relación con el Valle de los Reyes. (b) Mapa que muestra el hábitat natural de Pistacia spp. y la distribución principal de Dipetrocarpus y Hopea (familia Dipterocarpaceae), excluyendo las pequeñas poblaciones de los Ghats occidentales del sur de la India. Las distribuciones de coníferas y Dipterocarpaceae se basan en diversas fuentes (consulte la Tabla complementaria S6). Los mapas se crearon utilizando QGIS 3.12 (https://qgis.org/en/site) y utilizan datos de mapas vectoriales de Natural Earth de (https://www.naturalearthdata.com/downloads/).

Además de las resinas de coníferas, nuestro análisis también apunta a la presencia de otro exudado de plantas aromáticas, que podría ser resina de pistacia o dammar. Los árboles de pistacia, en particular P. terebinthus y P. lentiscus, son nativos de la región costera mediterránea, desde el sur de España hasta el Levante (Fig. 7B). Ambas especies tienen una larga historia de uso de sus resinas, produciendo resinas de trementina y masilla, respectivamente. Más allá de su uso en el antiguo Egipto81, fuentes clásicas posteriores muestran cuán ampliamente se utilizaron estas resinas en todo el Mediterráneo82. Mientras tanto, las especies de árboles que producen dammars (principalmente en Dipterocarpaceae) crecen exclusivamente en los bosques tropicales del sudeste asiático83. Por lo tanto, la evidencia de este tipo de resina de goma exótica es inesperada y no se ha informado en bálsamos de momificación del antiguo Egipto del segundo milenio a.C. Si se confirma, la presencia de resina de damar, identificada recientemente en bálsamos de Saqqara, que datan del primer milenio a. C.31, sugeriría que los antiguos egipcios tenían acceso a resinas del Sudeste Asiático que llegaron al Mediterráneo a través de un comercio a larga distancia hace casi un siglo. milenio antes. El hallazgo de granos de pimienta en las fosas nasales de la momia del faraón Ramsés II, fechado ca. 1200 a. C. 84,85. Esta especia es endémica sólo de los bosques húmedos del sur de la India86. Incluso un intercambio anterior entre África e India se insinúa por la presencia de cultivos de origen africano en el subcontinente indio hacia el año 2000 a. C., donde se cultivaban en granjas de Harappa84. Sin embargo, estas primeras conexiones comerciales a larga distancia siguen siendo muy poco conocidas, sin evidencia de cultura material asociada, y Pistacia es la identificación más parsimoniosa en la actualidad. Si se confirma, esto representaría una de las primeras identificaciones directas de resina de Pistacia en un bálsamo de momificación. Aparte de su aparición en el bálsamo de Nebiri, la resina de Pistacia también se utilizó en la preparación de momias “vituallas” o de comida de finales de la Dinastía XVII y principios de la XVIII, cuando se aplicaba a algunos de sus ataúdes y vendajes de madera74. En general, los hallazgos apuntan a evidencia temprana de comercio de plantas y/o sustancias vegetales exóticas entre Egipto y sus vecinos cercanos, con la posibilidad de que existieran vínculos comerciales tempranos que se extendieran más lejos.

Nuestro análisis revela rica información sobre el estatus social, la perspicacia tecnológica y el comercio que se puede obtener de vasijas arqueológicas aparentemente vacías excavadas hace más de un siglo. Se suma a un número creciente de estudios que destacan el valor de aplicar nuevos métodos para investigar rastros y residuos amorfos, así como especímenes de museo conservados durante mucho tiempo31,41,53,73,87,88,89,90. Junto con estos otros estudios, nuestros hallazgos demuestran que la química analítica es capaz de arrojar luz significativa sobre la identificación de los ingredientes incluidos en los bálsamos antiguos, añadiendo sustancialmente información recuperable de fuentes textuales antiguas. En el momento en que Howard Carter descubrió las vísceras de Senetnay, los métodos que hemos empleado en este estudio no se habrían imaginado posibles. Sin embargo, más de 120 años después, la tumba real conocida como KV 42 y su contenido continúan proporcionando nueva información sobre las prácticas culturales, la sociedad y el comercio del antiguo Egipto. Por lo tanto, nuestro estudio destaca no sólo el invaluable papel de la ciencia en la investigación arqueológica sino también la importancia de conservar el patrimonio cultural en condiciones óptimas a largo plazo.

Las muestras del bálsamo de momificación se recogieron de dos vasijas canópicas de piedra caliza del antiguo Egipto en el Museo August Kestner de Hannover. Las tinajas datan de la XVIII Dinastía (1450 a. C.) y contienen las vísceras de la noble dama Senetnay. Mientras los frascos estuvieron vacíos, una fina capa de residuo orgánico se conservó en el fondo de cada uno. Se recogieron muestras del material de embalsamamiento del frasco canópico 1 (que contiene los pulmones) y del frasco 2 (que contiene el hígado) de varias partes del frasco (paredes y fondo de los frascos; consulte la figura complementaria S1). Antes de recolectar estas muestras, se eliminó una fina capa superficial en los puntos de muestreo específicos utilizando bisturíes desechables para evitar la contaminación. Posteriormente, se tomaron muestras de debajo de la capa superficial con un bisturí. De cada lugar, ca. Se tomaron 200 mg de costra residual. Esto no fue posible para los restos adheridos a las paredes de las tinajas, ya que las capas eran muy delgadas y los residuos se conservaban en su mayor parte dentro de la matriz porosa de la piedra caliza. En estos casos, los residuos se eliminaron con un bisturí sin quitar primero la capa superficial para recuperar suficiente material (aproximadamente 100 a 200 mg) para el análisis. Todas las muestras se colocaron inmediatamente en viales de vidrio que previamente se quemaron a 500 °C durante 8 h para eliminar posibles contaminantes, hasta su posterior procesamiento en condiciones de laboratorio limpias en el laboratorio del Instituto Max Planck para la Ciencia de la Historia Humana, Jena, Alemania.

El metanol (MeOH), el diclorometano (DCM) y el metil terc-butil éter (MTBE) utilizados para los análisis, así como los estándares analíticos de ácido isopimárico y ácido vainílico, se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Munich, Alemania). Además, se obtuvo ácido 7-oxodeshidroabiético de Campro Scientific (Berlín, Alemania), ácido deshidroabiético de Carbosynth (Berkshire, Reino Unido), ácido pimárico de Abcam (Berlín, Alemania), ácido palustrico de Toronto Research Chemicals (Toronto, Canadá), ácido neoabiético y ácido oleanónico de Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Alemania), ácido damarrenólico de Enzo Life Sciences (Lörrach, Alemania), ácido morónico de TCI Chemicals (Eschborn, Alemania), cumarina de LGC Standards (Wesel, Alemania) y ácido benzoico. de Agilent Technologies (Frankfurt, Alemania). El ácido fórmico (FA) de grado MS se adquirió de VWR (Lovaina, Bélgica), mientras que el acetonitrilo (ACN) y el agua utilizados para los análisis HPLC-MS/MS se adquirieron de Biosolve (Valkenswaard, Países Bajos).

Las muestras se extrajeron siguiendo protocolos establecidos91,92, realizándose modificaciones para la extracción de muestras antiguas. Brevemente, se homogeneizaron entre 50 y 100 mg de la muestra hasta obtener un polvo fino y se extrajo con disolvente utilizando una mezcla de extracción MTBE:MeOH (3:1, v/v). Después de agitar la mezcla durante 45 minutos, las muestras se sometieron a ultrasonidos durante 15 minutos. Posteriormente, a cada muestra se le añadió una solución de H2O:MeOH (3:1, v/v) y se volvió a mezclar bien. Luego las muestras se centrifugaron a 20.000 xg durante 5 min. En esta etapa, se formó una densa bolita de proteínas precipitadas en el fondo, así como dos fases líquidas: (1) una fase superior que contiene los lípidos hidrófobos, que se forman debido a la baja densidad del MTBE y (2) una fase inferior con Metabolitos polares y semipolares. Cada una de las dos fases líquidas se transfirió por separado a nuevos viales de vidrio, mientras que el sedimento restante se lavó con metanol y se almacenó en un congelador a -80 °C para futuros análisis paleoproteómicos, en espera del desarrollo de más material de referencia vegetal en bases de datos de referencia de proteínas. Se derivatizaron alícuotas de muestras con la fase que contiene lípidos con 100 μL de N, O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA, que contiene 1% de TMCS, Sigma-Aldrich) durante 60 minutos a 70 ° C y luego se analizaron por GC-MS. La fase inferior que contenía los metabolitos polares se secó en un concentrador de vacío y se resuspendió en MeOH de grado HPLC antes del análisis LC-ESI-MS/MS.

Los análisis de GC-MS se realizaron utilizando un sistema GC Agilent 8890 acoplado a un GC/MSD Agilent 5977B. La separación cromatográfica se logró en una columna capilar HP-5ms de 60 m × 250 μm (Agilent) con un espesor de película de 0,25 μm. El espectrómetro de masas se operó en modo de impacto electrónico (EI) a 70 eV y se usó helio como gas portador con un caudal constante de 1,0 ml/min. La temperatura del horno de GC se fijó en 60 °C y se mantuvo durante 2 minutos, luego se aumentó a 120 °C a una velocidad de 30 °C/min y se mantuvo durante 2 minutos. La temperatura se aumentó nuevamente a 5 °C/min hasta 320 °C con un tiempo de retención final de 15 min. El tiempo total de ejecución fue de 61 min con un retraso del disolvente de 6,5 min. El volumen de inyección fue de 1 μl y se utilizó una proporción de división de 10:1 para mejorar las formas de los picos. El rango de exploración se estableció entre m/z 30 y 700 uma. Se realizaron blancos de inyección entre cada muestra para evitar el arrastre. La temperatura de la línea de transferencia y de la fuente se establecieron en 250 °C y 230 °C, respectivamente.

Los análisis de GC-MS a alta temperatura se realizaron en un GC Agilent 8860 acoplado a un espectrómetro de masas 5977B. Las muestras (1 µl) se inyectaron en una columna DB-1HT (15 m × 250 µm de diámetro interior, 0,1 µm de espesor de película) utilizando un inyector de enfriamiento en columna. Se utilizó helio como gas portador con un caudal constante de 1,2 ml/min. El horno de GC se programó de la siguiente manera: después de 2 minutos a 50 °C, la temperatura se aumentó a 350 °C a una velocidad de 10 °C/min. Esta temperatura final se mantuvo durante 10 min. La temperatura de la línea de transferencia, la fuente de iones y el cuadrupolo se establecieron en 350 °C, 230 °C y 150 °C, respectivamente, mientras que la temperatura de entrada se configuró para seguir la temperatura del horno. Se utilizó ionización electrónica a 70 eV y los datos se registraron en barrido completo desde m/z 50 a 800 uma después de un retraso del disolvente de 5 minutos.

El análisis LC-ESI-MS/MS se realizó utilizando un sistema de triple cuadrupolo Shimadzu LCMS-8050. El HPLC estaba equipado con bombas binarias LC-30AD, un desgasificador de disolventes DGU-20A5R, un horno de columna CTO-20AC y un muestreador automático SIL-30AC. La separación cromatográfica se realizó en una columna Shimadzu Shimpack Velox SP-C18 (100 mm × 2,1 mm, tamaño de partícula de 2,7 µm) y una columna analítica Restek Raptor Bifenil (100 mm × 2,1 mm, 2,7 µm) de tamaño de partícula. La fase móvil consistió en H2O de grado HPLC y 0,1 % de FA (fase móvil A) y ACN (fase móvil B). La temperatura de la columna se fijó en 25 °C y el programa de gradiente fue de 0,5 % B de 0 a 1 min, a 80 % B a los 10 min, a 100 % B a los 15 min, mantenido hasta los 17,5 min, y de nuevo a 0,5 %. B y mantenido hasta los 20 min. El caudal de disolvente se mantuvo en 0,2 ml/min para los análisis utilizando la columna C18 y 0,3 ml/min para los análisis con la columna de bifenilo, y los volúmenes de inyección se establecieron en 1 o 2 µl (dependiendo de la concentración de la muestra). La ionización se realizó con una fuente de iones de ionización por electropulverización (ESI) con detección en modo positivo y negativo. Todas las muestras fueron analizadas por duplicado.

El procesamiento y análisis de datos de GC-MS se realizó utilizando el software Agilent MassHunter Qualitative Data Analysis 10.0. La identificación de picos se llevó a cabo basándose en la comparación con los tiempos de retención y los espectros de masas de los estándares analíticos cuando estaban disponibles, en comparación con la biblioteca de espectros de masas de referencia NIST (2.2) y con los espectros informados en la literatura. Los datos de LC-MS/MS se recopilaron y procesaron utilizando el software LabSolutions (Shimadzu, Kyoto, Japón). Se utilizó el modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) para el análisis, con estándares analíticos auténticos para la optimización de los parámetros de MRM empleados para detectar compuestos específicos en muestras arqueológicas (consulte la Tabla complementaria S3 para obtener una lista de todos los compuestos y la Tabla S4 para los parámetros de MRM) .

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios. Para obtener más información, póngase en contacto con Barbara Huber ([email protected]).

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Los autores agradecen al Museo August Kestner en Hannover por proporcionar muestras de ambos vasos canopos de Senetnay para su análisis, y a la Sociedad Max Planck por financiar esta investigación y la publicación de este manuscrito en acceso abierto en el marco del Proyecto DEAL. B. Huber agradece a la Fundación Joachim Herz la concesión de una beca complementaria para ciencias biológicas interdisciplinarias para su investigación de doctorado.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Departamento de Arqueología, Instituto Max Planck de Geoantropología, Jena, Alemania

B. Huber, DK Jha, DG Vassão, T. Larsen, RN Spengler, P. Roberts y N. Boivin

Instituto de Ciencias Arqueológicas, Universidad Eberhard Karl de Tübingen, Tübingen, Alemania

B.Huber

Departamento de Química y Farmacia, Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg, Erlangen, Alemania

S. Hammann

Colecciones egipcias e islámicas, Museo August Kestner, Hannover, Alemania

CE Loeben

Departamento de Bioquímica, Instituto Max Planck de Ecología Química, Jena, Alemania

Director General Vassão

Grupo de Investigación Antropógena y Domesticación, Instituto Max Planck de Geoantropología, Jena, Alemania

RN Spengler

Instituto de Arqueología, University College London, Londres, Reino Unido

DQ Fuller

Grupo de Investigación isoTROPIC, Instituto Max Planck de Geoantropología, Jena, Alemania

P.Roberts

Centro Europeo para la Investigación y la Enseñanza de Geociencias Ambientales (CEREGE), Universidad de Aix Marsella, Aix-en-Provence, Francia

T. Devièse

Facultad de Ciencias Sociales, Universidad de Queensland, Brisbane, QLD, Australia

N.Boivin

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BH y NB diseñaron la investigación. BH, SH y DGV realizaron los trabajos de laboratorio. BH, SH, DKJ y TD analizaron e interpretaron los datos. El CEL brindó acceso al material arqueológico e información sobre la historia de las vasijas canopos. DQF y RNS proporcionaron los antecedentes arqueobotánicos y DQF preparó los mapas botánicos. PR, CEL y NB asesoraron sobre los antecedentes arqueológicos. BH preparó el borrador original y escribió el manuscrito con NB, incluidas las aportaciones de todos los coautores. PR, TD y NB supervisaron la investigación. Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a B. Huber o N. Boivin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Huber, B., Hammann, S., Loeben, CE y col. Caracterización biomolecular de bálsamos de momificación del antiguo Egipto de 3500 años de antigüedad del Valle de los Reyes. Representante científico 13, 12477 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39393-y

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Recibido: 28 de marzo de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 31 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39393-y

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